Historie objevování inzulínu


Po mnoho let před objevením inzulínu byl diabetes mellitus považován za smrtící nemoc. Jedinou známou metodou léčby onemocnění, která se projevuje oslabujícím uvolňováním velkého množství sladké moči, bylo dodržovat přísnou dietu navrženou Dr. Allenem s ostrým omezením příjmu sacharidů, což vedlo k vyčerpání. Takoví pacienti mohli prodloužit životy na několik let, ale bolestivá smrt na ně nevyhnutelně čekala.

V šedesátých letech 18. století objevil německý student Paul Langergans při studiu slinivky břišní „malé buňky s brilantním obsahem, uspořádané ve skupinách náhodně po celé slinivce břišní“. Jejich funkce nebyla známa. Později, na počest vědce, byly tyto skupiny těchto buněk nazývány Langerhansovými ostrůvky. V roce 1889 zjistil slavný vědec Oscar Minkowski (1858-1931), že diabetes mellitus se vyvíjí u psů se vzdálenou slinivkou břišní. Nicméně, další experimenty ukázaly, že pokud je kanál vázán, skrz který pankreatická šťáva vstupuje do střeva, vzniknou potíže s trávením, ale hladina glukózy v krvi se nezvýší. Na základě svých experimentů dospěl Oskar Minkowski k závěru, že slinivka břišní má dvě funkce: produkuje trávicí šťávy a látku, která se uvolňuje přímo do krve a reguluje hladiny glukózy. Případ zůstal malý, izolovat tuto látku a byl nalezen lék na diabetes. Ale to bylo přesně to, co vědci nemohli dělat mnoho let.

V říjnu 1921, v kanadském městě Toronto, Frederick Banting, chirurg, který nedávno získal lékařské vzdělání, četl článek Dr. Mosese Barrona o spojení mezi ostrůvky Langerhansových ostrovů a nástupem diabetu. S odkazem na práci ruského vědce Leonida Vasilijeva Soboleva, Dr. Barron popsal klinický případ, ve kterém byl kanál pankreatu blokován kamenem, který způsobil poškození tkáně orgánu, ale buňky ostrůvků zůstaly nedotčeny. Bunting se snažil izolovat tyto buňky. On navrhl, že pankreatické trávicí šťávy mohou být fatální pro buňky ostrůvků.

Ve svém deníku napsal:

  • obvaz pankreatického kanálu u psa. Počkejte na úplnou atrofii tkáně orgánů, udržujte buňky ostrůvků naživu;
  • Snažte se tyto buňky izolovat co nejvíce z trávicích šťáv a izolovat je.

Frederick Grant Banting.

Od Insulin Discovery 1982, Michael Bliss, University of Chicago Publishing.

Začátkem roku 1921 se Banting obrátil se svým nápadem na profesora na univerzitě v Torontu, Johna MacLeoda, jednoho z nejvýznamnějších vědců té doby, který studoval cukrovku. MacLeod nesdílel Bantingovo nadšení, v té době bylo na světě učiněno mnoho pokusů izolovat buňky ostrůvků mnohem zkušenějšími vědci a všechny nevedly k úspěchu. Frederickovi Banttingovi se však podařilo přesvědčit McLeoda, aby dal jeho nápad šanci, mladý vědec dostal malou, špatně vybavenou laboratoř a 10 psů. Pomocný student medicíny Charles Best byl také spojen s Bantingem. Experiment začal v létě 1921.

John MacLeod.

(Journal of Laboratory and Clinical Medicine, číslo 20, str. 1934-35).

Na začátku experimentů neměl Banting ani Best vynikající teoretické znalosti a praktické dovednosti. Profesor Mcleod učil Besta, aby okamžitě odstranila slinivku břišní, a také dal řadu praktických rad a brzy odešel na letní dovolenou do rodného Skotska. Také v této době existovala nová metoda stanovení koncentrace glukózy v krvi, která vyžadovala pouze 0,2 ml krve a ne 25 ml jako dříve. Tento průlom sehrál velkou roli v objevování inzulínu, protože bylo obtížné zhodnotit účinnost získané látky bez stanovení hladiny glukózy v krvi a časté krevní testy používající staré metody vedly k vyčerpání již slabých pacientů.

Banting a Best zahájili své experimenty odstraněním pankreatu u experimentálních psů, což vedlo ke zvýšení hladin glukózy v krvi, častého močení, žízně a hubnutí. U psů se rozvinula cukrovka.

V jiné skupině psů byl svazek pankreatu vázán, část produkující trávicí šťávy byla atrofována. U experimentálních psů byla slinivka břišní vyříznuta a zmrazena v roztoku soli a potom přefiltrována. Izolovaná látka nazvaná "Ailetin". Výsledná látka byla podávána psům s diabetes mellitus, snížila se hladina glukózy v krvi. Příznaky diabetu, které dostávaly několik injekcí denně, zmizely u psů, vypadaly zdravé a silné. Banting a Best ukázali výsledky MacLeodovi, byl ohromen, ale požadoval další testy, aby potvrdil výsledek.

Frederick Banting a Calz Best na střeše University of Toronto, 1921.

Vědci pochopili, že pro další výzkum potřebují větší množství účinné látky, bylo rozhodnuto použít pankreaty skotu. Počet úspěšných experimentů se zvýšil, MacLeod si uvědomil, že vědci jsou na pokraji největšího objevu a vybrali pro experimenty větší laboratoř, která mu poskytla všechny potřebné zdroje. Navrhl také pojmenovat získanou látku. Experimenty pokračovaly.

Koncem roku 1921 se ke skupině vědců připojil další účastník - biochemik Bertram Kollip. Jeho cílem bylo vyčistit výslednou látku, aby ji bylo možné použít k léčbě lidí. V průběhu studie také vědci dospěli k závěru, že celá slinivka břišní může být použita bez použití dlouhého procesu atrofie jeho trávicí části.

Vědci se snažili začít používat inzulín u lidí. Banting a Best se snažili vstřikovat inzulín sami sobě, ale kromě slabosti a zimnice nebyly nalezeny žádné další projevy. 11. ledna 1922, inzulín byl nejprve představen k Torontu 14-rok-starý chlapec, Leonard Thompson, trpět cukrovkou, jehož jediná léčba byla vyčerpávající dieta hypohydrate. První injekce bohužel nevedla k požadovaným výsledkům, hladina glukózy v krvi se snížila, ale pouze nepatrně se místo vpichu injekce stalo zánětlivým. Biochemik Bertram Collip pokračoval ve své práci na čištění inzulínu. 23. ledna byla stejnému pacientovi znovu podána injekce inzulínu. Výsledek byl ohromující, hladina glukózy klesla z 29 mmol / l na 6,7 ​​mmol / l. Pacient se cítil lépe každý den, postupně získával sílu a váhu. Vědci pokračovali v testování inzulínu u jiných pacientů s diabetem.

Zprávy o objevu inzulínu rychle přeletěly nad oceánem av roce 1923 udělil Nobelovu komisi Bantingovi a Macleodovi Nobelovu cenu za fyziologii a lékařství. Byl to obrovský úspěch. Nicméně, Frederick Banting byl rozzlobený rozhodnutím Nobelovy komise, on věřil, že on a Charles Best by měli sdílet úspěch. Aby vzdal hold Bestovu příspěvku k objevení inzulínu, Banting mu dal polovinu své části Nobelovy ceny, MacLeod, na oplátku sdílel svou část s Bertram Collipem. Debata o spravedlnosti Nobelovy ceny se již dlouho neztratila. Přes skutečnost, že mnoho současníků věřilo, že Mcleod si nezasloužil cenu, jeho příspěvek k objevu inzulínu nemůže být popírán, protože to byl on kdo dal myšlenku Banting pohybu, poskytovat jemu laboratoř a dávat cenné rady od samého začátku studia. Rovněž je třeba si uvědomit, že bez spojení profesora MacLeoda se zpráva o objevu nerozšířila tak široce a možná, že za objevem inzulínu byli jména jiných lidí.

Banting a McLeod přijali patent na jejich vynález, který za $ 1 byl prodán Toronto univerzitě, všechny peníze od použití který šel k nadaci, která financuje výzkum.

Krátce po otevření zahájila společnost Eli Lilly rozsáhlou výrobu této látky. Do roku 1923 vyráběla společnost dostatek inzulínu, aby zásobila všechny pacienty na severoamerickém kontinentu. Inzulín přinesl do Evropy nositel Nobelovy ceny Augustus Krokh.

Navzdory skutečnosti, že inzulín není lékem na diabetes, je jeho objev jedním z největších průlomů vědy dvacátého století. Diabetes přestal být větou, což znamená, že člověk má jen několik měsíců, které zbývá žít v trápení. Lidé s diabetem dostali šanci žít šťastný, dlouhý život.

Historie objevování inzulínu

„Aby si pacient mohl důvěřovat svému vlastnímu životu, musí zvládnout definici dávky a podávání inzulínu velmi dobře,“ řekl J. Macleod pro otevření inzulínu v roce 1923, který získal Nobelovu cenu za fyziologii a medicínu.

Inzulínová terapie je jednou z nejdůležitějších metod léčby diabetes mellitus (s diabetes mellitus 1. typu). Je to díky ní, že diabetes přestal být smrtelnou nemocí, což vedlo k smrti během několika měsíců. Jak již víme, inzulín byl poprvé použit k léčbě v roce 1922 a cesta k němu nebyla snadná.

Všechno to začalo tím, že v roce 1889 způsobil Oscar Minkowski a Joseph von Mehring experimentální cukrovku u psa, odstranění jeho slinivky břišní. V roce 1901 prokázal ruský patolog Leonid Sobolev, že cukrovka je spojena s narušením práce ne celého slinivky břišní, nýbrž pouze té části, která se nazývá Langerhansovy ostrůvky, a také naznačila, že tyto ostrůvky obsahují nějakou látku, která reguluje metabolismus sacharidů. Sobolev nedokázal izolovat tuto látku v čisté formě.

První pokusy o to byly provedeny v roce 1908 Georgem Ludwigem Zulzerem. Německý specialista byl schopen extrahovat extrakt z pankreatu, se kterým se neúspěšně pokusil léčit pacienta umírajícího na diabetes - stav pacienta se dočasně zlepšil. Extrakt však skončil a muž zemřel. V roce 1911 se Zülzer pokusil patentovat jeho objev, ale nemohl to okamžitě udělat, a během první světové války byla jeho laboratoř uzavřena, ve stejné době, v letech 1911 - 1912, E. Scott, pracující na University of Chicago, použitý extrakt vody slinivky břišní pro léčbu psů s experimentálně indukovaným diabetes mellitus a poznamenal, že hladina cukru v krvi u laboratorních zvířat mírně poklesla. Scott však nebyl předurčen k tomu, aby věc předložil k logickému závěru - jeho manažer se ukázal jako krátkozraký člověk a zastavil práci laboratoře v tomto směru. Izrael Kleiner, který na tomto problému pracoval v roce 1919 na Rockefellerově univerzitě, měl také smůlu: hospodářská krize, která následovala po světové válce, přerušila jeho výzkum.

F. G. Banting (1891-1941)

Frederick Grant Banting měl své vlastní skóre s diabetem - jeho přítel zemřel na tuto nemoc. Poté, co absolvoval lékařskou fakultu v Torontu a sloužil jako vojenský chirurg v oblastech první světové války, stal se asistentem na lékařské fakultě University of Western Ontario. V říjnu 1920, když četl lékařský článek o ligaci vylučovacích kanálků slinivky břišní, Banting se rozhodl zkusit tuto metodu použít k získání látky ze žlázy s vlastnostmi snižujícími cukr. S žádostí o poskytnutí laboratoře pro provádění experimentů se obrátil na profesora John MacLeod na univerzitě v Torontu. Starší kolega byl lépe obeznámen s výzkumem v této oblasti a považoval je za nekompromisní, ale mladý vědec byl natolik naléhavý, že ho Macleod nemohl odmítnout.

Profesor Bantingovi poskytl nejen laboratoř, ale i deset psů, a co je nejdůležitější, vybral si asistenta. Byl to senior student, Charles Best, který dokonale zvládl metody určování hladiny cukru v krvi a moči (pak to nebylo vůbec tak jednoduché, jak je dnes). Pro jiné výzkumné účely Banting prodal celý svůj majetek (historie mlčí o tom, jaká je jeho velikost, ale stačilo to pro experimenty). Zatímco MacLeod odpočíval ve Skotsku, Banting a Best svázali kanály pankreatu psů a napjatě čekali na výsledky. V srpnu 1921 se jim podařilo izolovat požadovanou látku. Zavedení této látky psovi, zbavenému vlastní slinivky břišní a umírání na ketoacidózu, výrazně zlepšilo stav zvířete, snížila se hladina cukru v krvi.

Do té doby se Mcleod vrátil. Když se dozvěděl o výsledcích mladých vědců, hodil všechny síly laboratoře k dalšímu rozvoji tématu. Izolace látky, která byla původně nazývána ailetinem (v jiném transkripci, iletin) z pankreatu psů, byla extrémně pracným procesem, protože trávicí enzymy zničily molekulu ailetinu. Banting navrhl použít pro tyto účely žlázu plodů telat, ve kterých již byl inzulin vyroben, a trávicí enzymy, které ztěžovaly uvolňování inzulínu, nebyly dosud k dispozici. Ukázalo se, a práce šla rychleji. Hlavní věc je, že ayletinová telata pomohla psům, navzdory druhovým rozdílům. Lék však způsobil závažné nežádoucí účinky spojené s přítomností proteinů a dalších látek v něm.

McLeod pozval Jamese Collipa, biochemika, aby vyčistil ayletin. Výsledek nebyl dlouho v příchodu: 11. ledna 1922, první injekce aylethin, 14-rok-starý Leonard Thompson, který zemřel na diabetes, dostal první injekci. Jak se říká, první palačinka vyšla v paušálu: alergická reakce vyvinutá pro teenagera, aby podával lék - čistota byla nedostatečná. Collip se posadil do laboratoře: Leonard se před očima vytratil a čas se mu zmenšoval. Po 12 dnech udělal druhý pokus. Tentokrát všechno šlo dobře a svět dostal nový lék. MacLeod navrhl Banting volat ho inzulín (od latiny. Insula - ostrov, jméno bylo nejprve znělo v 1910: endokrinolog Edward Sharpay-Schafer pojmenoval tento druh substance, nedostatek který, podle jeho předpokladů, způsobí diabetes). Takže teď nazýváme tento zázračný lék.

Leonard Thompson, který ve věku 14 let vážil 25 kg, žil dalších 13 let relativně aktivního života a zemřel na závažnou pneumonii (antibiotika v té době neexistovala a úmrtnost na pneumonii byla vysoká). Drancování Banting převedlo práva na patent na nový lék na univerzitu v Torontu, když za to obdržel jeden dolar. Bylo důležitější, že se mu podařilo zachránit život svého druhého přítele, lékaře Joe Gilchrisa.

Potřeba inzulínu byla extrémně vysoká. Banting přijal balíčky dopisů s žádostí, aby pomohl umírajícím lidem... Mezitím první inzulín pokračoval v podávání vedlejších reakcí - v místě vpichu byly infiltráty (těsnění) a dokonce i abscesy. Jeden z Bantingových známých, podnikatel Eli Lilly, koupil patent od University of Toronto (dánská společnost Novo-Nordisk zároveň získala licenci současně) a zahájila průmyslovou výrobu inzulínu, přičemž investovala značné prostředky do zlepšování jejich čištění. Tvůrcem Novo-Nordisk byl lékař Avgust Krogh, jehož manželka se stala jedním z prvních pacientů v Bantingu. Farmaceutické společnosti Eli Lilly a Novo-Nordisk patří stále mezi přední společnosti v této oblasti.

Ve spravedlnosti je třeba poznamenat, že v roce 1921, několik měsíců před Bantingem a Bestem, zveřejnil rumunský badatel Nicolae Paulescu výsledky své práce, ve které popsal vliv látky, kterou obdržel od slinivky břišní psa, kterou nazýval pankreatin (nyní tento termín označuje komplex trávicího ústrojí). pankreatických enzymů). Ale příběh rozhodl, že vědecká komunita si tyto publikace nevšimla. Později si je pamatovali mnohem později...

V 1923, pro vytvoření inzulínu, Banting a McLeod přijal Nobelovu cenu. Proč jí neudělali společně s Bestu a Collipem? Chtěl bych se zeptat členů poroty, ale... Rozhořčeně Banting vůbec nechtěl cenu nejprve přijmout, ale pak změnil názor a rozdělil získané peníze na polovinu s Best. MacLeod udělal totéž - předal polovinu ceny Collipovi.

Přestože sediment zůstal. Později se výzkumný tým rozpadl - zdálo se, že Banting (a možná to tak bylo?) Ten MacLeod podcenil svou roli při objevování inzulínu a Collip v tomto sporu podporoval profesora.

Inzulín začal žít sám, odděleně od tvůrců, života. McLeod přednášel na University of Aberdeen ve Skotsku, kde po mnoho let vedl katedru fyziologie.

Banting, kterému byl přiznán doživotní důchod, se v roce 1923 stal doktorem vědy, profesorem, vedeným Institutem Banting a Best, byl zvolen členem londýnské Královské společnosti, měl mnoho dalších čestných titulů a regál, které mu však nebránily v tom, aby byl rád lékem v oblasti letectví. V roce 1941, během pracovního letu souvisejícího s organizací lékařské pomoci v armádě, zemřel při letecké havárii poblíž Newfoundlandu.

V paměti a díky tomuto muži Světová zdravotnická organizace vyhlásila 14. listopadu - narozeniny Fridricha Bantinga - den boje proti diabetu.

Mezitím práce pokračovala. První insuliny byly stále špatně vyčištěny, dávky nebyly ověřeny a nebyly k dispozici dostatečné kontroly glukózy. Hypoglykémie, abscesy v místě podání léku, alergické reakce - to vše nuceno neustále zlepšovat inzulín.

První z nich měl další nevýhodu - velmi krátkou dobu jednání. Musely být podávány často, takže vědci přemýšleli, jak prodloužit účinek inzulínu tak, aby zachránili pacienty před opakovanými injekcemi během dne. Při hledání látky, která zpomaluje vstřebávání inzulínu, a tím i prodloužení jeho působení, vyzkoušelo mnoho možností: lecitin, arabskou gumu, cholesterol... Všechno nebylo k ničemu.

Pokusili se zpracovat inzulíny s kyselými sloučeninami, aby chránili před škodlivými účinky trávicích enzymů pankreatu.

Kromě toho kyselé prostředí prodloužilo absorpci a tím prodloužilo dobu působení inzulínu. Škoda - „kyselé“ inzulíny způsobily mnoho lokálních reakcí: zarudnutí, bolest, infiltráty.

Další úsilí bylo zaměřeno na neutralizaci roztoku a zlepšení stupně čištění. V roce 1936 se dánskému průzkumníkovi Hagedorn podařilo vytvořit první inzulin s neutrální kyselinkou a po 10 letech tvrdé práce byl získán „rozšířený“ inzulin, který se nazýval Hagedornův neutrální irotamin (NPH). Dnes je aktivně využíván po celém světě.

NPH byl získán přidáním speciálního proteinu, protaminu, izolovaného z lososového mléka, do proteinově purifikovaného vepřového inzulínu.

Protamin má alkalické vlastnosti a zpomaluje absorpci inzulínu z podkožní vrstvy tuku. Během dlouhé historie aplikace protaminového inzulínu existuje pouze několik zpráv o vývoji alergických reakcí na něj.

Dalším způsobem, jak prodloužit absorpci inzulínu, bylo přidání zinku k protaminovému inzulínu (inzulín zinková suspenze - ICS nebo protamin zinek inzulín - PDH) a doba trvání účinku závisí na stavu inzulínu, pokud má krystalickou strukturu, lék funguje déle, pokud ne krystalické (amorfní) - kratší.

Prvním lékem ICS byl Lente inzulín, který se skládal ze 3 částí amorfního prasete a 7 dílů bovinního krystalického inzulínu. Později byl vytvořen Monotard - obsahuje pouze vepřový inzulin - 3 části amorfní a 7 částí krystalické.

Inzulín je signifikantně nižší u ICS než protamin, takže nemohou být smíchány s „krátkým“ inzulínem, který bude vázán volným protaminem a celá směs se změní na dlouhodobě působící inzulín. NPH přípravky obsahují stejné množství inzulínu a protaminu, a proto s nimi nic neohrožuje „krátký“ inzulín. Tato vlastnost je spojena s jiným názvem NPH - isofan-inzulín (z latiny. Isophan - rovno). Tyto léky přetrvávaly v těle dlouhou dobu - 12 hodin nebo více.

Na oslavu bylo rozhodnuto přejít na režim podávání 1-2-krát inzulínu, ale prodloužení práce s inzulínem hrálo krutý vtip s pacienty: přenos hmoty na jednu injekci denně vedl k prudkému zhoršení kontroly cukru a následně k dekompenzaci onemocnění. Ukázalo se, že tato možnost není vhodná pro každého - s diabetem typu 1 nebylo možné dosáhnout kontroly cukru tímto způsobem: buď dávky byly malé a glykémie i nadále klesala, nebo dávky byly vysoké, a pak následovaly epizody hypoglykémie. Střed nefungoval. Bylo jasné, že jsme potřebovali „krátké“ i „prodloužené“ inzulíny.

To nyní víme o bazální a post-potravinové sekreci glukózy a inzulínu, ale pak to bylo ještě daleko, a vědci v mnoha ohledech byli, co se nazývá, na dotek. Byl tedy učiněn závěr o potřebě individuálního výběru režimu inzulínové terapie pro každého pacienta. Kromě protaminu a zinku byly k inzulínům přidány látky s dezinfekčními vlastnostmi, díky nimž obsah lahvičky zůstává po dlouhou dobu sterilní a při opakovaném použití inzulínové stříkačky nebo jehly nevznikají žádné bakteriální komplikace. Tyto látky jsou přítomny v inzulínu v takových malých koncentracích, že nemají žádný vliv na lidské tělo.

Společnosti vyrábějící inzulíny používají jako konzervační látky různé látky, proto se doporučuje používat „krátký“ a „rozšířený“ inzulín stejné společnosti. Pokud však taková možnost neexistuje, není vyloučena kombinace léků od různých výrobců, a to ani při zavedení do jedné injekční stříkačky, hlavní věc je, že „prodloužený“ inzulin neobsahuje zinek.

Inzulín měl štěstí, jako žádná jiná veverka - za vývoj, který se s ním týkal, byly uděleny další dvě Nobelovy ceny: v roce 1958 ocenění získal chemik Fridrich Sanger - byl schopen kompletně rozluštit aminokyselinové složení inzulínu, nejen lidí, ale také různých druhů zvířat, V roce 1964 se vítězem stala Dorothy Crawfort-Hodgkinová, která studovala prostorovou strukturu molekuly inzulínu.

Již jsme řekli, že inzulín je protein, což znamená, že se skládá z řetězce sekvenčně spojených aminokyselin. Kravský inzulín se liší od lidských tří aminokyselin, vepřového - jednoho. Rovněž byla studována možnost použití inzulínů z jiných zvířat, zejména velryb a ryb. Od 80. let minulého století začal být opuštěn kravský inzulín. Proč přestal dělat specialisty? Faktem je, že čím větší je rozdíl ve struktuře a složení molekuly, tím častěji se v lidském těle vytvářejí imunitní komplexy pro cizí inzulín, který na jedné straně blokuje účinek inzulínu snižujícího cukr (inzulín je vázán protilátkami, které se na něj objevují) a na druhé straně, uloženy na vnitřních stěnách cév, což zvyšuje jejich poškození. Zdá se, že život je prodloužený, ale zároveň se zrychluje rozvoj komplikací diabetu, kdy byl vždy upřednostňován prasečí inzulin, i když nebyly bezchybné.

Pokračovali jsme v aktivním hledání způsobů, jak syntetizovat inzulín, který by zcela zopakoval jeho strukturu u lidí. V důsledku let výzkumu v roce 1978 se inzulín stal prvním lidským proteinem, který mohl být syntetizován genetickým inženýrstvím.

Jakmile se dozvěděli, jak se dostat lidský inzulín, oni také postupně začali odmítat vepřové maso. V současné době je v mnoha zemích světa z etických důvodů zakázána výroba přípravků ze zvířecích orgánů, avšak vepřový inzulin je stále velmi rozšířený, zejména v rozvojových zemích, což je dáno relativně nízkou cenou tohoto léku.

V naší zemi, nyní v arzenálu endokrinologa jsou hlavně vysoce kvalitní lidský inzulín. Získávají se různými způsoby: polosynteticky, když aminokyselina alaninu, která není pro nás vhodná v molekule prasečího inzulínu, je nahrazena aminokyselinou threoninem (čímž se dosahuje úplné identity produktu získaného pro lidský inzulín) a biosyntetickým použitím genetického inženýrství „nutí“ E. coli nebo kvasinky k syntéze proinzulinu, ze kterého je následně odstraněn C-peptid, který je nám již znám.

Technologie posledně uvedeného způsobu je přibližně stejná v DNA Escherichia coli nebo kvasinkové houbě, vkládají lidský proinzulinový gen a hostitelská buňka nové DNA začíná syntetizovat lidský proinzulin. Poté se z ní odštěpí C-peptid, zbývající inzulín se přečistí z nečistot proteinů hostitelské buňky, stabilizuje se a prodlouží se protaminem nebo zinkem (v případě „prodlouženého“ inzulínu) se injikují konzervační látky, vše se zabalí a získá se to, co je potřeba. - rekombinantní geneticky upravený lidský inzulin. V těchto dnech se nejčastěji používají tyto možnosti inzulínu. V posledních letech byly vyvinuty a aktivovány takzvané analogy lidského inzulínu: jejich aminokyselinové složení je stejné jako jejich složení, ale sekvence aminokyselinových sloučenin byla změněna. To umožnilo změnit hlavní charakteristiky akce: čas začátku, čas výskytu vrcholu a jeho závažnost, stejně jako dobu trvání.

Tabulka 61. Inzulíny používané u pacientů s diabetes mellitus (podle Dedova II, Shestakova M.V., 2009)

Historie inzulínu. Podívej se do minulosti

Podle Mezinárodní diabetické federace s diabetes mellitus je v současné době 542 000 dětí mladších 14 let, 415 milionů dospělých a do roku 2040 se předpokládá, že počet lidí s diabetem dosáhne 642 milionů lidí 1.

Zvýšení počtu lidí s diabetem je jistě spojeno se změnami v životním stylu (pokles fyzické aktivity), stravovacími návyky (konzumace potravin bohatých na snadno stravitelné sacharidy, živočišné tuky), ale zároveň ukazuje, že díky objevu moderního snižování cukru léky, vytváření metod kontroly onemocnění, vývoj algoritmů pro diagnostiku a léčbu komplikací diabetu mellitus, délka života lidí s diabetem začala růst, nemluvě o zlepšení jeho kvality _________

Lidstvo ví o diabetu 3,5 tisíce let (jak je známo, první pojednání popisující toto onemocnění, egyptský papyrus Herbes, pochází z roku 1500. př.nl), nicméně v léčbě tohoto vážného onemocnění se vyskytlo pouze asi 90 lidí. před lety, kdy diabetes, včetně prvního typu, přestal být trestem smrti.

Předpoklady pro vytvoření inzulínu

Již v 19. století, během pitvy pacientů, kteří zemřeli na diabetes, bylo zjištěno, že ve všech případech byla slinivka břišní vážně poškozena. V Německu v roce 1869 Paul Langergans zjistil, že v tkáních pankreatu existují určité skupiny buněk, které se nepodílí na tvorbě trávicích enzymů.

V roce 1889, v Německu, fyziolog Oskar Minkowski a lékař Joseph von Mehring, experimentálně prokázali, že odstranění pankreatu u psů vede k rozvoji diabetu. To jim umožnilo předpokládat, že slinivka vylučuje specifickou látku zodpovědnou za metabolickou kontrolu těla 2. Hypotéza Minkowski a Meringa nalezla nové a nové potvrzení a v prvním desetiletí 20. století, zkoumající vztah mezi diabetem a ostrůvkem Langerhansových ostrůvků pankreatu, objevem endokrinní sekrece, bylo prokázáno, že určitá látka vylučovaná buňkami Langerhansových ostrůvků hraje hlavní roli. v regulaci metabolismu sacharidů 3. Myšlenka vznikla, že je-li tato látka izolována, může být použita k léčbě diabetu, nicméně výsledky pokračování experimentů Minkowski a Merking, když byl psům podáván extrakt po odstranění slinivky břišní, což v některých případech vedlo ke snížení glykosurie nebyly reprodukovatelné, a zavedení samotného extraktu způsobilo zvýšení teploty a dalších vedlejších účinků.

Evropští a američtí vědci, jako například Georg Sulzer, Nicola Paulesko 4, Izrael Kleiner, praktikovali zavedení pankreatického extraktu diabetickým pacientům, ale vzhledem k velkému počtu vedlejších účinků a problémů spojených s financováním nebyli schopni experimenty dokončit.

Myšlenka Fredericka Bantinga

V roce 1920, Frederic Banting, 22-rok-starý chirurg, se pokusil otevřít svou praxi v malém kanadském městě, a při absolvování učil na University of Western Ontario. V pondělí 31. října měl Banting říct studentům o metabolismu sacharidů - téma, ve kterém on sám nebyl silný, a aby se lépe připravil, Banting si přečetl nedávný článek M. Barrona, který byl v poslední době popsán v neděli večer, kde popsal blokádu pankreatu. duktální žlučové kameny a výsledná atrofie acinárních buněk (buněk odpovědných za exokrinní funkci) 2. Téhož večera Banting napsal svůj nápad: „Bandáže pankreatických kanálků u psů. Počkejte na atrofii acini, izolujte tajemství z buněk ostrůvků, aby se usnadnila glukosurie. “5 Když Banting nedosáhl praxe, šel na univerzitu v Torontu, jeho alma mater, kde se obrátil na profesora Johna MacLeoda, jednoho z předních odborníků na metabolismus sacharidů. Ačkoli profesor přijal myšlenku Banting bez nadšení, vybral laboratoř s minimálním vybavením a 10 psů pro chirurga. Asistent Banting se stal studentem Charlesem Bestem. V létě 1921 začal experiment.

Banting a Best začali svůj výzkum odstraňováním pankreatu u psů. U některých zvířat vědci odstranili slinivku břišní, v jiných svázali kanál pankreatu a po určité době odstranili žlázu. Pak byl atrofovaný slinivkový materiál umístěn do hypertonického roztoku a zmrazen. Látka získaná jako výsledek po rozmrazení byla podávána psům s odstraněnou slinivkou břišní a klinikou diabetu. Výzkumníci zaznamenali pokles hladin glukózy a zlepšili tak pohodu zvířete. Profesor MacLeod byl ohromen výsledky a rozhodl se, že bude i nadále dokazovat, že Bantingův a Bestův „pankreatický extrakt“ skutečně funguje.

Nové výsledky experimentů s použitím pankreatu skotu umožnily pochopit, že je možné bez komplikovaného postupu podvázání pankreatického kanálu.

V pozdní 1921, Bertin Collip, biochemik, připojil se k výzkumnému týmu. S použitím frakčního srážení s různými koncentracemi alkoholu a dalšími metodami čištění byly získány extrakty pankreatických ostrůvků, které mohly být bezpečně zavedeny do lidského těla. Je to účinná a netoxická látka a byla použita v prvních klinických studiích 6.

Klinické studie

Zpočátku Banting a Best zažili inzulín, který dostali. V důsledku zavedení léku, oba cítili slabou, závrať, ale žádné toxické účinky léku byly zaznamenány.

První pacient s diabetem, který obdržel inzulín 11. ledna 1922. se stal 14letým chlapcem Leonardem Thompsonem. Po první injekci 15 ml inzulínu nedošlo k žádným významným změnám ve stavu pacienta, hladina glukózy v krvi a v moči se mírně snížila, navíc se u pacienta vyvinula sterilní absces. Opakovaná injekce byla provedena 23. ledna a v reakci na normalizovanou hladinu glukózy v krvi se snížil obsah glukózy a ketonů v moči, přičemž samotný chlapec zaznamenal zlepšení ve vlastní pohodě 7.

Jedním z prvních pacientů, kteří dostávali inzulín, byla dcera ředitele Nejvyššího soudu USA, Elizabeth Heges Goshet. Překvapivě, před zahájením léčby inzulínem, měla 4 roky diabetes a léčba, která jí umožnila žít dodnes, byla těžká dieta (asi 400 kcal denně). Na inzulínové terapii žila Elizabeth 73 let a porodila tři děti.

Nobelova cena

V roce 1923 udělil Nobelovu komisi cenu Bantingovi a MacLeodovi v oblasti fyziologie a medicíny. Stalo se to jen 18 měsíců po první zprávě o přípravě na zasedání Asociace amerických lékařů. Toto rozhodnutí zhoršilo již tak obtížný vztah mezi vědci, protože Banting věřil, že McLeodův příspěvek k vynálezu inzulínu byl velmi přehnaný, podle Bantinga, cena měla být rozdělena mezi něj a jeho asistentem Best. K obnově spravedlnosti, Banting sdílel jeho část ceny s Best, a MacLeod s biochemikem Collip 8.

Patent na vytvoření inzulínu, vlastněný Bantingem, Best a Collip, vědci prodali za 3 dolary University of Toronto. V srpnu 1922 byla uzavřena dohoda o spolupráci s farmaceutickou společností Eli Lilly a C o, která pomohla zavést výrobu léčiv v průmyslovém měřítku.

Od vynálezu inzulínu uplynulo více než 90 let. Léky tohoto hormonu se zlepšují, od roku 1982 již pacienti dostávali lidský inzulín a v 90. letech se objevily analogy lidského inzulínu - léky s různou dobou účinku, ale musíme si uvědomit, že lidé, kteří začali tento lék vytvářet, šetří každý den miliony lidí. lidí

Historie tvorby inzulínu;

Snad nejdůležitějším a nejčastěji používaným hormonálním lékem v lékařské praxi je inzulín. Lidský inzulín - hormon syntetizovaný beta buňkami slinivky břišní - hraje obrovskou roli v procesech normálního fungování lidského těla.

Jeho nejdůležitější funkcí je poskytnout buňkám těla hlavní energetický materiál, glukózu.

Pokud inzulín nestačí, buňky nejsou schopny absorbovat glukózu, hromadí se v krvi a tkáně a orgány prožívají energetické hladovění. Při nedostatku inzulínu se vyvíjí závažné onemocnění, jako je diabetes mellitus.

Až do počátku XX století. pacienti s diabetem zemřeli v dětství nebo mladí z různých komplikací jejich nemoci, téměř nikdo nemohl žít více než 5-7 let po nástupu onemocnění.

Role pankreatu ve vývoji diabetu se stala známou až na konci století XIX. V roce 1869 studoval v Berlíně 22letý student medicíny Paul Langergans mikroskopem strukturu slinivky břišní a upozornil na dříve neznámé buňky, které tvoří skupiny, které byly rovnoměrně rozloženy po celé žláze, ale funkce těchto buněk, později nazývaných Langerhansovy ostrovy., zůstal neznámý.

Pozdnější, Ernst Lako předpokládal, že slinivka břišní je zapojená do procesů trávení. V roce 1889 se německý fyziolog Oskar Minkowski snažil dokázat, že hodnota pankreatu v trávení je vymodelována. Za tímto účelem připravil experiment, ve kterém odstranil u zdravého psa žlázu. Několik dní po zahájení experimentu, asistent Minkowski, který sledoval stav laboratorních zvířat, upozornil na velký počet mouch, které letěly přes moč experimentálního psa.

Po prozkoumání moči zjistil, že pes bez pankreatu vylučuje cukr močí. Toto bylo první pozorování, které spojovalo práci pankreatu a rozvoj diabetu. V roce 1901 prokázal Eugene Opie, že diabetes mellitus je způsoben poruchami ve struktuře slinivky břišní, a to úplnou nebo částečnou destrukcí Langerhansových ostrůvků.

První, kdo byl schopen izolovat inzulín a úspěšně jej aplikovat na léčbu pacientů, byl kanadský fyziolog Frederick Banting. Pokus o vytvoření léku pro mladé vědce na cukrovku vytlačil tragické události - dva jeho přátelé zemřeli na cukrovku. Ještě dříve, než se Banting, mnoho výzkumníků, kteří chápou roli pankreatu ve vývoji diabetu, snažili izolovat látku, která by přímo ovlivňovala hladinu cukru v krvi, ale všechny pokusy skončily neúspěchem.

Tyto poruchy byly mimo jiné způsobeny skutečností, že pankreatické enzymy (hlavně trypsin) alespoň částečně rozložily molekuly inzulínového proteinu dříve, než mohly být izolovány z extraktu tkáně žlázy. V roce 1906 se Georg Ludwig Zeltser podařilo dosáhnout určitého úspěchu při snižování hladiny glukózy v krvi experimentálních psů pomocí extraktu pankreatu, ale nemohl pokračovat ve své práci. Scott v roce 1911 na univerzitě v Chicagu použil vodný extrakt slinivky břišní a zaznamenal mírný pokles glykosurie u experimentálních zvířat, ale nemohl přesvědčit svého vůdce o významu svého výzkumu a brzy byly tyto experimenty přerušeny.

Stejný efekt prokázal izraelský Kleiner v roce 1919, ale nedokončil práci kvůli začátku první světové války.

Podobná práce v roce 1921 byla publikována profesorem fyziologie rumunské lékařské fakulty Nicola Paulesco a mnoho z nich, včetně Rumunska, jej považuje za objevitele inzulínu. Avšak zásluhou izolace inzulínu a jeho úspěšného použití patří právě Frederick Banting.

Banting působil jako docent na katedře anatomie a fyziologie na kanadské univerzitě pod vedením profesora Johna MacLeoda, který byl poté považován za velkého specialisty na diabetes. Banting se snažil dosáhnout atrofie slinivky břišní bandážováním svých vylučovacích kanálků (kanálů) po dobu 6–8 týdnů, při zachování Langerhansových ostrůvků v nezměněné podobě od účinků enzymů pankreatu a získání čistého extraktu buněk těchto ostrůvků.

K provedení tohoto experimentu byla požadována laboratoř, asistenti a experimentální psi, které Banting neměl.

Pro pomoc se obrátil na profesora Johna MacLeoda, který si byl dobře vědom minulých neúspěchů při získávání pankreatických hormonů. Proto nejprve nedovolil Bantingovi do své laboratoře. Nicméně, Banting ne ustoupil a na jaře 1921 on znovu žádal MacLeod být povolen k práci v laboratoři pro přinejmenším dva měsíce. Od té doby se MacLeod chystal do Evropy a laboratoř byla svobodná, souhlasil. Jako asistent, Banting dostal 5. ročník vysokoškoláka Charles Best, který studoval metody pro stanovení hladiny cukru v krvi a moči dobře.

K provedení experimentu, který vyžadoval velké výdaje, musel Banting prodat téměř celý svůj majetek.

Několik psů bylo svázáno s kanály pankreatu, po kterém začali čekat na jeho atrofii. 27. července 1921 byl podán atrofovaný pankreatický extrakt psovi se vzdálenou slinivkou břišní umístěnou v precomu. Po několika hodinách pes snížil hladinu cukru v krvi a moči a aceton zmizel.

Pak byl podruhé zaveden extrakt pankreatu a žila dalších 7 dní. Možná, že by pes žil déle, ale vědci vyčerpali extrakty, protože inzulín byl získán z pankreatu psů, což bylo extrémně pracné a zdlouhavé.

Následně Banting a Best začali získávat extrakt z pankreatu nenarozených telat, ve kterých ještě nebyly produkovány trávicí enzymy, ale již bylo syntetizováno dostatečné množství inzulínu. Množství inzulínu je nyní dostatečné, aby udržovalo experimentálního psa naživu až 70 dní. MacLeod, který se v té době vrátil z Evropy, se postupně začal zajímat o práci Bantinga a Besta a spojil s tím všechny laboratorní pracovníky. Banting, který původně nazýval získaný Islinin extrakt pankreatu, na návrh MacLeoda, přejmenoval to na inzulín (od latiny. Insula - “ostrov”).

Výroba inzulínu pokračovala úspěšně. 14. listopadu 1921, Banting a Best oznámil výsledky jejich výzkumu u setkání fyziologického žurnalistického klubu univerzity Toronto. O měsíc později následovala zpráva ve Spojených státech amerických v Americké fyziologické společnosti v New Haven.

Množství extraktu získaného z pankreatu skotu poraženého na jatkách začalo rychle růst a odborník byl požádán, aby zajistil jemné čištění inzulínu. Za tímto účelem, na konci roku 1921, přivedl MacLeod k práci slavného biochemika Jamese Collipa, který velmi rychle dosáhl dobrých výsledků při čištění inzulínu. V lednu 1922 zahájili Banting a Best první klinické studie s inzulínem u lidí.

Zpočátku vědci injekčně aplikovali 10 jednotek inzulínu a pak dobrovolníka, který byl 14 letý chlapec, Leonard Thompson, který trpěl cukrovkou. První injekce mu byla podána 11. ledna 1922, ale nebyla zcela úspěšná, protože extrakt nebyl dostatečně vyčištěn, což vedlo k rozvoji alergií. Dalších 11 dní Collip tvrdě pracoval v laboratoři na zlepšení extraktu a 23. ledna byla podána druhá injekce inzulínu chlapci.

Po zavedení inzulínu se chlapec začal rychle zotavovat - byl to první člověk, kterého inzulín zachránil. Brzy, Banting zachránil jeho přítele, doktor Joe Gilchrist, od nadcházející smrti.

Zpráva o prvním úspěšném použití inzulínu 23. ledna 1922 se stala mezinárodní senzací. Banting a jeho kolegové doslova vzkříšili stovky diabetiků, zejména těch, kteří měli těžké formy. Byl napsán mnoho dopisů žádajících o záchranu z nemoci, přišel k němu v laboratoři. V té době však bylo ještě mnoho nedostatků - inzulínový preparát nebyl dostatečně standardizován, nebyly k dispozici žádné prostředky pro sebeovládání a dávka inzulínu musela být měřena zhruba okem. Proto hypoglykemické reakce organismu často nastaly, když hladina glukózy klesla pod normu.

Zlepšení inzulínu a jeho zavedení do každodenní lékařské praxe však pokračovalo.

Univerzita Toronto začala prodávat licence výroby inzulínu k různým farmaceutickým společnostem a do roku 1923 byl tento hormon dostupný všem diabetikům.

Lily (USA) a Novo Nordisk (Dánsko), které jsou stále lídry v této oblasti, získaly povolení vyrábět léky. V 1923, Bantingu univerzita Toronto udělil titul Doctor vědy, on byl volen profesor. Bylo také otevřeno speciální oddělení lékařského výzkumu pro Banting a Best, kterým byly přiděleny vysoké osobní platy.

V 1923, Banting a McLeod získal Nobelovu cenu ve fyziologii a medicíně, který oni dobrovolně sdíleli to s Best a Collip.

V roce 1926 byl lékařský lékař Abel schopen syntetizovat inzulin v krystalické formě. Po 10 letech dánský výzkumník Hagedorn obdržel prodloužený (prodloužený) inzulín a o 10 let později byl vytvořen neutrální protamin Hagerdon, který stále zůstává jedním z nejpopulárnějších typů inzulínu.

Chemické složení inzulínu bylo založeno britským molekulárním biologem Frederickem Sangerem, který za to v roce 1958 obdržel Nobelovu cenu. Inzulín byl prvním proteinem, jehož aminokyselinová sekvence byla kompletně dekódována.

Prostorová struktura molekuly inzulínu byla stanovena metodou rentgenové difrakce v 90. letech. Dorothy Crouft Hodgkin, která byla také oceněna Nobelovou cenou.

Po obdržení bantingového bovinního inzulínu byly provedeny pokusy s inzulínem získaným z pankreatických žláz prasat a krav, jakož i jiných zvířat (například velryb a ryb).

Molekula lidského inzulínu se skládá z 51 aminokyselin. Vepřový inzulin se od něj liší pouze v jedné aminokyselině, v krávě - ve třech, což jim nebrání v normalizaci hladin cukru. Inzulín živočišného původu má však významnou nevýhodu - u významné části pacientů způsobuje alergickou reakci. Proto byla nutná další práce na zlepšení inzulínu. V roce 1955 byla struktura lidského inzulínu dešifrována a intenzivní práce začala jeho izolací.

Poprvé to bylo možné v roce 1981 americkými vědci Gilbertem a Lomedikem. O něco později byl získán inzulin, získaný z pekařských kvasinek genetickým inženýrstvím. Inzulín byl prvním lidským proteinem syntetizovaným v roce 1978 geneticky modifikovanou bakterií E. coli. To bylo od něj v biotechnologii začala nová éra. Od roku 1982 začala americká společnost Genentech prodávat lidský inzulín syntetizovaný v bioreaktoru. Tento inzulin nemá alergický účinek na lidské tělo.

Historie inzulínu je jedním z nejpozoruhodnějších příběhů mimořádných objevů ve farmakologii. Význam objevu a syntézy inzulínu je již prokázán skutečností, že za práci s touto molekulou byly uděleny tři Nobelovy ceny. Diabetes mellitus je i nadále nevyléčitelnou nemocí do současnosti, pouze neustálé injekce magické medicíny mohou zachránit životy pacientů.

Dosud však nebyla dosažena dokonalost produkce inzulínu, má své vlastní vedlejší účinky (například lipodystrofie se vyskytuje v místě vpichu injekce atd.), Proto stále probíhá úsilí o zlepšení nebo změnu kvality syntetizovaných inzulínů.

Historie objevování inzulínu

Inzulín jako peptidový hormon produkovaný v beta buňkách ostrůvků Langerhans pankreatu. Zajištění permeability buněčných membrán pro molekuly glukózy jako její hlavní funkce. Klasifikace inzulínových přípravků a jejich příjem.

Zaslat dobrou práci do znalostní báze je jednoduchá. Použijte níže uvedený formulář.

Studenti, postgraduální studenti, mladí vědci, kteří ve své studii a práci využívají znalostní základnu, vám budou velmi vděční.

Publikováno dne http://www.allbest.ru/

Úvod

Insulimn (z Lat. Insula - ostrov) - hormon peptidové povahy, je tvořen v beta buňkách ostrůvků Langerhans slinivky břišní. Má mnohostranný vliv na metabolismus téměř ve všech tkáních.

Hlavní funkcí inzulínu je zajistit permeabilitu buněčných membrán pro molekuly glukózy. Ve zjednodušené formě můžeme říci, že nejen sacharidy, ale také všechny živiny jsou nakonec rozděleny na glukózu, která se používá k syntéze jiných molekul obsahujících uhlík a je jediným typem paliva pro buněčné elektrárny - mitochondrie. Bez inzulínu klesá permeabilita buněčné membrány na glukózu 20krát a buňky odumírají hladem a přebytečný cukr rozpuštěný v krvi otravuje tělo.

Porušení sekrece inzulínu v důsledku destrukce beta buněk - absolutní nedostatek inzulínu - je klíčovým prvkem v patogenezi diabetu 1. typu. Porušení účinku inzulínu na tkáň - relativní nedostatek inzulínu - má důležité místo ve vývoji diabetu 2. typu.

Historie objevování inzulínu

Historie objevování inzulínu je spojena se jménem ruského lékaře I.M. Sobolev (druhá polovina 19. století), který prokázal, že hladina cukru v lidské krvi je regulována zvláštním hormonem pankreatu.

V roce 1922 byl inzulín izolovaný z pankreatu zvířete poprvé představen desetiletému diabetickému chlapci. výsledek překonal všechna očekávání a o rok později vydala americká společnost Eli Lilly první přípravek na výrobu zvířecího inzulínu.

Po obdržení první průmyslové dávky inzulínu v příštích několika letech došlo k obrovskému způsobu jeho izolace a čištění. V důsledku toho byl hormon dostupný pro pacienty s diabetem 1. typu. pankreatické membrány inzulínového hormonu

V roce 1935 dánský výzkumník Hagedorn optimalizoval účinek inzulínu v těle tím, že navrhl prodlouženou medikaci.

První krystaly inzulínu byly získány v roce 1952 av roce 1954 anglický biochemik G.Senger rozluštil strukturu inzulínu. Vývoj metod čištění hormonu z jiných hormonálních látek a produktů degradace inzulínu umožnil získat homogenní inzulin, nazývaný jednosložkový inzulín.

Na počátku 70. let. Sovětští vědci A. Yudaev a S. Shvachkin navrhli chemickou syntézu inzulínu, ale realizace této syntézy v průmyslovém měřítku byla nákladná a nerentabilní.

V budoucnu došlo k postupnému zlepšování stupně purifikace inzulínů, což snížilo problémy způsobené alergiemi na inzulín, zhoršenou funkcí ledvin, poruchami zraku a imunitní rezistencí vůči inzulínu. Nejúčinnější hormon byl potřebný pro substituční léčbu diabetes mellitus - homologního inzulínu, tj. Lidského inzulínu.

V 80. letech umožnil pokrok v molekulární biologii syntetizovat oba řetězce lidského inzulínu pomocí E.coli, které pak byly spojeny s molekulou biologicky aktivního hormonu a rekombinantní inzulin byl získán na Institutu bioorganické chemie Ruské akademie věd pomocí geneticky upravených kmenů E.coli.

Použití afinitní chromatografie významně snížilo obsah kontaminujících proteinů s vyšší molekulovou hmotností než inzulín v přípravku. Tyto proteiny zahrnují proinzulin a částečně štěpené proinzuliny, které jsou schopny indukovat produkci antiinzulinových protilátek.

Použití lidského inzulínu od začátku léčby minimalizuje výskyt alergických reakcí. Lidský inzulín se vstřebává rychleji a bez ohledu na formu léku má kratší trvání účinku než zvířecí inzulín. Lidské inzulíny jsou méně imunogeny než prasečí, zejména smíšené hovězí a vepřové insuliny.

Typy inzulínu

Inzulínové přípravky se liší stupněm purifikace; zdroj produkce (skot, prasata, člověk); látky přidávané do roztoku inzulínu (prodloužení jeho účinku, bakteriostatika atd.); koncentrace; hodnota pH; ICD míchání s IPD.

Inzulínové přípravky se liší podle zdroje. Vepřové a hovězí inzulín se liší od lidského v aminokyselinovém složení: hovězí ve třech aminokyselinách a vepřovém v jednom. Není překvapující, že při léčbě bovinním inzulínem se nežádoucí účinky vyvíjejí mnohem častěji než při léčbě prasaty nebo lidským inzulínem. Tyto reakce jsou vyjádřeny v imunologické inzulinové rezistenci, alergii na inzulin, lipodystrofii (změna podkožní tkáně v místě vpichu injekce).

Přes zřejmé nevýhody bovinního inzulínu, to je ještě široce používané ve světě. I když imunologicky, nedostatky bovinního inzulínu jsou zřejmé: v žádném případě se nedoporučuje předepisovat pacientům s nově diagnostikovaným diabetem, těhotným ženám nebo pro krátkodobou inzulinovou terapii, například v perioperačním období. Negativní vlastnosti hovězího inzulínu se také uchovávají při použití ve směsi s prasaty, takže smíšené (prasečí a hovězí) inzulíny by také neměly být používány k léčbě těchto kategorií pacientů.

Lidské inzulínové přípravky pro chemickou strukturu jsou zcela identické s lidským inzulínem.

Hlavním problémem biosyntetického způsobu získávání lidského inzulínu je úplné čištění konečného produktu z nejmenších nečistot použitých mikroorganismů a jejich metabolických produktů. Nové metody kontroly kvality zajišťují, že lidský biosyntetický inzulin neobsahuje žádné škodlivé nečistoty; jejich stupeň čištění a účinnost snižující glukózu tak splňují nejvyšší požadavky a jsou téměř stejné. Jakékoli nežádoucí vedlejší účinky, v závislosti na nečistotách, tyto léky nemají inzulín.

V současné době se v lékařské praxi používají tři typy inzulínů:

- krátký dosah s rychlým nástupem účinku;

- průměrná doba trvání akce;

- dlouhé působení s pomalým účinkem.

Tabulka 1. Charakteristika komerčních inzulinových preparátů

Příklady (obchodní názvy)

Methylparaben m-krezolový fenol

NaCl Glycerin Na (H) PO4 Na acetát

Člověk Vepřový býk

Aktrapid-NM, Humulin-R Aktrapid, Aktrapid-MS Insulin pro injekce (SSSR, již se nevyrábí)

Člověk Vepřový býk

Protafan-NM, Humulin-N Protafan-MS Protamin-inzulín (SSSR, již se nevyrábí)

Člověk Vepřový býk

Monotard-NM, Humulin-zink Monotard-MS, Lente-MS Lente

Krátkodobě působící inzulín (ICD) - běžný inzulin - je krátkodobě působící krystalický zinek-inzulin, který je rozpustný při neutrálním pH, jehož účinek se vyvíjí do 15 minut po subkutánním podání a trvá 5-7 hodin.

První prodloužený inzulin (SDI) byl vytvořen koncem 30. let, takže pacienti mohli provádět injekce méně často, než když užívali ICD, pokud možno jednou denně. Aby se prodloužilo trvání účinku, všechny ostatní inzulínové přípravky jsou modifikovány a, když jsou rozpuštěny v neutrálním médiu, tvoří suspenzi. Obsahují protamin ve fosfátovém pufru - protamin zinek-inzulín a NPH (neutrální protamin Hagedorn) - NPH-inzulín nebo různé koncentrace zinku v acetátovém pufru - ultralente inzulín, páska, seventile.

Inzulínové přípravky se střední dobou trvání obsahují protamin, což je průměrný protein m. 4400, bohatý na arginin a odvozený z pstruha duhového. Pro tvorbu komplexu je zapotřebí poměr protaminu a inzulínu 1:10. po subkutánním podání proteolytické enzymy zničí protamin, což umožňuje vstřebání inzulínu.

NPH-inzulín nemění farmakokinetický profil regulačního inzulínu smíšeného s ním. NPH-inzulín je výhodnější než inzulinová páska jako složka průměrného trvání účinku v terapeutických směsích obsahujících normální inzulín.

Ve fosfátovém pufru, všechny inzulíny snadno tvoří krystaly se zinkem, ale pouze bovinní inzulínové krystaly jsou dostatečně hydrofobní, aby poskytovaly pomalé a stálé uvolňování inzulínu charakteristické pro ultralente. Krystaly zinečnatého inzulínu se rychleji rozpouštějí, účinek přichází dříve, doba trvání účinku je kratší. Proto neexistuje žádný lék ultralente, obsahující pouze prasečí inzulín. Monokomponentní prasečí inzulín se vyrábí pod názvem inzulínová suspenze, inzulin neutrální, inzulín izofan, inzulin aminochinurid.

Inzulínová páska je směs 30% inzulínu semilentu (amorfní inzulinová sraženina s ionty zinku v acetátovém pufru, jehož účinek se rychle rozptýlí) se 70% ultralente inzulínu (špatně rozpustný krystalický zinek inzulín, který má opožděný nástup a prodloužený účinek). Tyto dvě složky poskytují kombinaci s relativně rychlou absorpcí a stabilním dlouhodobým působením, což činí inzulínovou pásku vhodným terapeutickým činidlem.

Produkce inzulínu

Lidský inzulín může být vyráběn čtyřmi způsoby:

1) kompletní chemická syntéza;

2) extrakce z pankreatu osoby (obě tyto metody nejsou vhodné z důvodu neefektivnosti: nedostatečný vývoj první metody a nedostatek surovin pro hromadnou výrobu druhou metodou);

3) polosyntetickou metodou za použití enzymově-chemické substituce v poloze 30 řetězce B aminokyseliny alaninu v insulinu prasat s threoninem;

4) biosyntetická metoda pro technologii genetického inženýrství. Poslední dvě metody umožňují získat vysoce čistý lidský inzulín.

V současné době se lidský inzulín získává hlavně dvěma způsoby: modifikací vepřového inzulínu syntetickou enzymatickou metodou a metodou genetického inženýrství.

Inzulín byl prvním proteinem získaným pro komerční účely za použití technologie rekombinantní DNA. Existují dva hlavní přístupy k získání geneticky upraveného lidského inzulínu.

V prvním případě oddělené (různé produkční kmeny) produkují oba řetězce následované složením molekuly (tvorba disulfidových můstků) a separací izoforem.

Ve druhé přípravě ve formě prekurzoru (proinzulinu) následovaného enzymatickým štěpením trypsinem a karboxypeptidázou B na aktivní formu hormonu. Nejvýhodnější v současné době je získání inzulínu jako prekurzoru, který zajišťuje správné uzavření disulfidových můstků (v případě oddělené produkce řetězců, následných cyklů denaturace, separace izoforem a renaturace).

V obou přístupech je možné buď jednotlivě získat výchozí složky (řetězce A a B nebo proinzulin), nebo jako součást hybridních proteinů. Kromě řetězců A a B nebo proinzulinu mohou být ve směsi hybridních proteinů přítomny:

- nosičový protein, který transportuje fúzní protein do periplazmatického prostoru buňky nebo kultivačního média;

- afinitní složka, což značně usnadňuje výběr hybridního proteinu.

Současně mohou být obě tyto složky současně přítomny ve složení hybridního proteinu. Kromě toho, při vytváření hybridních proteinů může být použit princip multidimenzionality (to znamená, že v hybridním proteinu je přítomno několik kopií cílového polypeptidu), což umožňuje výrazně zvýšit výtěžek cílového produktu.

Ve Spojeném království byly oba lidské inzulínové řetězce syntetizovány za použití E. coli, které pak byly spojeny s molekulou biologicky aktivního hormonu. Aby jednobuněčný organismus mohl syntetizovat molekuly inzulínu na svých ribozomech, je nezbytné, aby mu byl dodán nezbytný program, tj. Aby do něj byl zaveden gen hormonu.

Chemicky je získán gen, který programuje biosyntézu inzulínového prekurzoru nebo dvou genů, které programují odděleně biosyntézu řetězců inzulínu A a B.

Dalším stupněm je zahrnutí genu pro inzulínový prekurzor (nebo řetězcové geny odděleně) do genomu E. coli, speciálního kmene E. coli pěstovaného za laboratorních podmínek. Tento úkol provádí genetické inženýrství.

Plazmid s odpovídajícím restrikčním enzymem se izoluje z E. coli. Syntetický gen je vložen do plazmidu (klonování s funkčně aktivní C-koncovou částí beta-galaktosidázy E. coli). Výsledkem je, že E.coli získává schopnost syntetizovat proteinový řetězec sestávající z galaktosidázy a inzulínu. Syntetizované polypeptidy jsou chemicky štěpeny z enzymu a poté purifikovány. V bakteriích se na bakteriální buňku syntetizuje přibližně 100 000 inzulinových molekul.

Povaha hormonální látky produkované E. coli je určena genem, který je vložen do genomu jednobuněčného organismu. Pokud je klonován prekurzorový gen inzulínu, bakterie syntetizuje prekurzor inzulínu, který je pak podroben restrikční enzymatické úpravě za účelem odstranění prepity s izolací C-peptidu, což vede k biologicky aktivnímu inzulínu.

K získání purifikovaného lidského inzulínu se hybridní protein izolovaný z biomasy podrobí chemické enzymatické transformaci a příslušnému chromatografickému čištění (frontální, gelová permeace, aniontová výměna). Rekombinantní inzulin byl získán na Ústavu RAS za použití geneticky upravených kmenů E. coli. Prekurzor, hybridní protein exprimovaný v množství 40% celkového buněčného proteinu, obsahujícího preproinzulin, se uvolňuje z pěstované biomasy. Jeho transformace na inzulin in vitro se provádí ve stejné sekvenci jako in vivo - vedoucí polypeptid se štěpí, preproinzulin se převádí na inzulín v průběhu stupňů oxidační sulfitolýzy následované redukčním uzavřením tří disulfidových vazeb a enzymatickou izolací vazby C-peptidu. Po sérii chromatografických purifikací, včetně iontové výměny, gelu a HPLC (vysoce výkonná kapalinová chromatografie) se získá lidský inzulín s vysokou čistotou a přirozenou aktivitou.

Může být použit kmen s nukleotidovou sekvencí vloženou do plazmidu exprimující fúzní protein, který se skládá z lineárního proinzulinu a proteinového fragmentu A Staphylococcus aureus připojeného k jeho N-konci.

Kultivace nasycené biomasy buněk rekombinantního kmene zajišťuje začátek produkce hybridního proteinu, jehož izolace a postupná transformace v zkumavce vede k inzulínu.

Jiný způsob je možný: ukazuje se v bakteriálním expresním systému, fúzním rekombinantním proteinu sestávajícím z lidského proinzulinu a polyhistidinového konce připojeného k němu přes methioninový zbytek. Izoluje se pomocí chelátové chromatografie na kolonách Ni-agarózy z inkluzních tělísek a štěpena bromkyanem.

Izolovaný protein je S-sulfonovaný. Mapování a hmotnostní spektrometrická analýza získaného proinzulinu, čištěného iontoměničovou chromatografií na aniontoměniči a RP (reverzní fáze) HPLC (vysokoúčinná kapalinová chromatografie), ukazují přítomnost disulfidových můstků odpovídajících disulfidovým můstkům nativního lidského proinzulinu.

V poslední době byla věnována velká pozornost zjednodušení postupu získávání rekombinantního inzulínu metodami genetického inženýrství. Například fúzní protein sestávající z vedoucího peptidu interleukinu 2 navázaného na N-konec proinzulinu může být získán přes lysinový zbytek. Protein je účinně exprimován a lokalizován v inkluzních tělískách. Po izolaci je protein štěpen trypsinem za vzniku inzulínu a C-peptidu.

Výsledný inzulin a C-peptid byly purifikovány pomocí RP-HPLC. Při vytváření fúzních struktur je hmotnostní poměr nosného proteinu k cílovému polypeptidu velmi významný. C-peptidy jsou spojeny principem head-tail s použitím aminokyselinových spacerů nesoucích restrikční místo Sfi I a dva argininové zbytky na začátku a na konci spaceru pro následné štěpení proteinu trypsinem. Produkty štěpení pomocí HPLC ukazují, že C-peptid je kvantitativně štěpen, což umožňuje použití způsobu multimerních syntetických genů pro produkci cílových polypeptidů v průmyslovém měřítku.

Závěr

Diabetes mellitus je chronické onemocnění způsobené absolutním nebo relativním nedostatkem inzulínu. Vyznačuje se hlubokou metabolickou poruchou sacharidů s hyperglykémií a glukosurií, jakož i dalšími metabolickými poruchami v důsledku řady genetických a vnějších faktorů.

Inzulín dodnes slouží jako radikální a ve většině případů jediný způsob, jak udržet život a invaliditu pacientů s diabetem. Před přijetím a zavedením inzulínu na kliniku v letech 1922-1923. Pacienti s diabetes mellitus typem jsem čekal na smrtící výsledek po dobu jednoho až dvou let od nástupu onemocnění, a to i přes použití nejvíce oslabující diety. Pacienti s diabetem typu I potřebují celoživotní substituční léčbu inzulinem. Ukončení z různých důvodů pro pravidelné zavedení inzulínu vede k rychlému rozvoji komplikací a bezprostřední smrti pacienta.

V současné době je diabetes z hlediska prevalence na 3. místě po kardiovaskulárních a onkologických onemocněních. Podle Světové zdravotnické organizace je prevalence diabetu mezi dospělou populací ve většině regionů světa 2-5% a existuje tendence zvyšovat počet pacientů téměř dvakrát za 15 let. Navzdory zjevnému pokroku v oblasti zdravotní péče se každoročně zvyšuje počet pacientů závislých na inzulínu a v současné době v samotném Rusku činí přibližně 2 miliony lidí.

Vytváření drog domácího lidského genetického inzulínu otevírá nové možnosti řešení mnoha problémů ruské diabetologie, aby se zachránily životy milionů lidí s diabetem.

1. Biotechnologie: učebnice pro univerzity / ed. N.S. Egorova, V.D. Samuilova.- M.: Higher School, 1987, str. 15-25.

2. Geneticky upravený lidský inzulín. Zvýšení účinnosti chromatografické separace s využitím principu bifunkčnosti. / Romanchikov, A.B., Yakimov, S.A., Klyushnichenko, V.E., Arutunyan, A.M., Vulfson, A.N. // Bioorganická chemie, 1997 - 23, č. 2

3. Egorov N. S., Samuilov V. D. Moderní metody tvorby průmyslových kmenů mikroorganismů // Biotechnologie. Prince 2. M.: Higher School, 1988. 208 s.

4. Imobilizace trypsinu a karboxypeptidázy B na modifikovaném oxidu křemičitém a jejich použití při přeměně rekombinantního lidského proinzulinu na inzulín. / Kudryavtseva N.E., Zhigis L.S., Zubov V.P., Vulfson A.I., Maltsev K.V., Rumsh L.D. Chem. Pharmacy. J., 1995 - 29, č. 1, str. 61 - 64.

5. Základy farmaceutické biotechnologie: průvodce studiem / ETC. Prishchep, V.S. Chuchalin, K.L. Zaikov, L.K. Michal. - Rostov na Donu: Phoenix; Tomsk: NTL Publishing, 2006.

6. Syntéza fragmentů inzulínu a studium jejich fyzikálně-chemických a imunologických vlastností. Panin L.E., Tuzikov F.V., Poteryaeva ON, Maksyutov A.Z., Tuzikova N.A., Sabirov A.N. // Bioorganic Chemistry, 1997–23, č. 12, str. 953–960


Následující Článek
Léčba uzlin štítné žlázy lněným olejem